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本制品是一种通过一次反应将双链DNA快速转变为可以用于后续的平末端连接反应的试剂盒。本试剂盒可以将含有5'或3'突出(5'- or 3'-overhang)的双链DNA转变为带有5'磷酸和3'羟基的平末端双链DNA，以便于有效地与平末端载体或接头进行连接反应。

本试剂盒提供的Blunting Enzyme Mix中含有的T4 DNA聚合酶同时具有3'→5'外切酶活性和5'→3'聚合酶活性，可把双链DNA的末端切平和补平并形成平末端。本试剂盒提供的平端化酶混合液中的T4多聚核苷酸激酶，可将平末端双链DNA的5'磷酸化，并且可以通过其3'磷酸酯酶活性将3'磷酸催化转变为3'羟基，确保可用于与后续载体或接头进行连接反应。

本试剂盒经过优化，单次反应可以使5μg的DNA平端化、5'磷酸化和3'羟基化。本试剂盒催化的反应请参考图1。

图1.DNA快速平端化试剂盒催化的双链DNA的平端化反应示意图。本试剂盒可以催化5'突出的补平(聚合酶反应)、3'突出的切平(3'外切酶反应)、5'羟基的磷酸化(5'多聚核苷酸激酶反应)和3'磷酸转变为3'羟基(3'磷酸酯酶反应)共4个常见的反应。蓝色和绿色分别代表不同的DNA序列。


对酶切、机械打断等片段化的DNA进行平端化处理，以便于与质粒、cosmid、fosmid或BAC载体、以及二代测序的DNA adaptor等进行连接；PCR产物、cDNA等进行平端化以便于进行平末端克隆或高通量测序接头连接。

组分	20T	100T
Blunting Enzyme Mix	20μL	100μL
10×Blunting Buffer	100μL	500μL
dNTP Mix(1mM)	60μL	300μL

保存：-20℃，有效期1年。

• PCR产物需要适当纯化后再用本制品进行平端化和5'磷酸化。
  
• 限制性内切酶消化产生的DNA很多情况下可以不经过纯化步骤，直接进行平端化、5'磷酸化和3'去磷酸化反应。虽然反应效率可能会有一定差异，但不会影响平端克隆。如果用于高通量测序建库，需要酌情考虑是否需要纯化后再进行后续反应。

图2.DNA快速平端化试剂盒平齐化和磷酸化DNA的效果图。

• 未加入Blunting Enzyme Mix；
  
• 用本DNA快速平端化试剂盒进行平端化和磷酸化反应；
  
• 以本DNA快速平端化试剂盒催化的平端化和磷酸化反应产物为底物，用快速DNA连接试剂盒进行连接；
  
• 用N公司的竞品进行平齐化和磷酸化反应；
  
• 以N公司的竞品催化的平端化和磷酸化反应产物为底物，用快速DNA连接试剂盒进行连接。

平端化和磷酸化反应体系(25μL)：0.8μM dsDNA,1×Blunting Buffer,0.1mM dNTP mix,1μL Blunting Enzyme Mix,25℃孵育15min，70℃孵育10min进行失活；随后取出2μL反应液，用无核酸酶水补足至5μL，加入1μL 6×DNA Loading Buffer，然后进行15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后用NadRed红色核酸染料室温染色15min，使用凝胶成像设备观察实验结果。连接反应体系(20μL)：8μL待连片段，1×Rapid Ligation Buffer,2μL Rapid T4 DNA ligase，25℃孵育15min，65℃孵育10min进行失活；随后取出5μL反应液，加入1μL 6×DNA Loading Buffer，然后进行15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后用NadRed红色核酸染料室温染色15min，使用凝胶成像设备观察实验结果。如图所示，本制品与N公司的竞品相比，具有类似的催化效果。dsDNA是由DNA Template和Primer按照DNA寡核苷酸退火缓冲液产品说明书中推荐的程序进行退火反应得到的产物，Template:5'-OH-ATACATAGATACATAGACTGGCCGTCGTTTTAC-OH-3',Primer:5'-OH-GTAAAACGACGGCCAGT-OH-3'。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

• 平端化、5'磷酸化和3'去磷酸化反应：
  
  • 参考下表，在冰浴上设置反应体系。
    

    成分	用量	终浓度
    无核酸酶水	(19-x)μL	-
    dsDNA (10μM)	xμL	0.8μM
    10×Blunting Buffer	2.5μL	1×
    dNTP Mix(1mM each)	2.5μL	0.1mM
    Blunting Enzyme Mix	1μL	-
    总体积	25μL	-

    • 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体；如果同时进行多个反应，可以把上表中除dsDNA之外的所有溶液和酶预混合，然后再分装到各反应管。
  • 反应条件：25℃孵育15min。
    
  • 终止反应：70℃孵育10min。
• 连接反应：
  推荐使用快速DNA连接试剂盒或T4 DNA连接酶或类似产品，以上述反应得到的产物作为底物，进行连接反应。连接反应体系和连接条件按照DNA连接试剂盒或T4 DNA Ligase的使用说明进行即可。

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